J Exp Med：烟酰胺单核苷酸转移酶（NNT）通过维持Fe-S蛋白功能而恒定NSCLC线粒体代谢

人类心脏病展现出新有力而比较简单的一氧化氮激素，也许是由肺组织的高氧适度造成的。由于活适度氧(ROS)的分解是这种激素的副产物，因此须要要以烟酰胺丝氨酸二核苷硫磷硫(NADPH)的形式来增大酸中毒，以快速反可不这种一氧化氮活适度的减极快。烟酰胺单核苷硫转移蛋白(NNT)可通过NADPH的分解来可维持一氧化氮的抗硝酸能够，但其在非小细胞内心脏病(NSCLC)之前的起到仍未指明。本学术研究推断出新NNT的理解在心脏病激素数学模型之前明显减极快了的形成和波及适度。另以外，有利于学术研究推断出新NNT不足之处就会引致一氧化氮机能障碍，这与酸中毒的大量增高无关，而是以铁硫亚基的活适度增大为标记。这些不足之处与NADPH的持续适度和ROS的积聚有关，这指明指出了NNT在大大降低这些关键亚基底物的硝酸之前起着关键起到。

物理设计

许多少用的心脏病激素数学模型是借助C57BL6/J激素的饲养意图而建立。有趣的是，这些激素载有纯合以外显子7-11的框内不足之处以及一氧化氮之前Nnt基因序列的错义凋亡引致非机能亚基的理解。因此，可以借助这种大自然不足之处的等位基因(NntΔex7-11)来评论者NNT对心脏病再次发生的各种因素。

首先，适用Kras凋亡(LSL-KrasG12D/+)引致的心脏病数学模型来扫描Nnt理解对心脏病再次发生的各种因素。载有Cre重组蛋白的腺病毒病菌LSL-KrasG12D/+激素，可抑止KrasG12D在肺上皮之前的理解和肺白血病的形成。借助LSL-KrasG12D/+激素和C57BL6/J激素交配季节转化成Nnt+/+理解激素或NntΔex7-11/Δex7-11理解激素(上图1A-1B)。该数学模型之前Nnt的理解引致Cre重组蛋白诱发的耗损加快3个同年(上图1C-1D)。然后，借助Kras凋亡与p53不足之处同时理解(LSL-KrasG12D/+；Trp53flox/flox，也称为KP)建立心脏病数学模型。Nnt的理解没有人彻底改变Cre抑止的KP激素的死亡率(上图1E)。有趣的是，在这个数学模型之前，p53的不足之处消除了Nnt理解对心脏病形成的各种因素，并且无论Nnt理解如何，物理最终都普遍存在明显的耗损(上图1F)。心脏病耗损比重的量化在相异等位基因激素之间没有人差别(上图1G-1H)。

虽然相异等位基因激素之间的耗损没有人差别，但确实捕捉到到数学模型之前波及适度的差别。我们推断出新Nnt+/+激素之前51.3%的为3级(白血病)或以上，而NntΔex7-11 / +和NntΔex7-11 /Δex7-11激素之前均36.5%和38.8%的是管理人员(上图1I)。Nnt+/+激素再次发生4级的振幅总体增高，证明波及适度的彻底改变(上图1J)。总之，这些图表指明指出了Nnt推动了心脏病的再次发生和波及。

2 NNT的不足之处不各种因素一氧化氮之前硫氧还亚基(TXN)的抗硝酸体系

为了有利于审核NNT对心脏病生物学的各种因素，首先审核shRNA扰乱NNT亚基的理解，都有4个理解NNT亚基的NSCLC细胞内系 (A549, H1299，H2009和PC9)和不理解NNT亚基的H441细胞内(上图2A)。扰乱NNT亚基理解可抑制NSCLC细胞内的凋亡能够(上图2B)。并且推断出新极快病毒病菌4过后NNT的持续上升增大了H2009和PC9细胞内的生存能够(上图2C)。此以外，H441细胞内的凋亡倍受NNT的各种因素。

并不一定认为NNT最小限度NADPH的氢化能够，从而可维持一氧化氮亚基抗硝酸系统会正处于氢化长时间(上图2D)。扰乱NNT增大了H1299、H2009和PC9细胞内之前NADPH: NADP+的比重 (上图2E)。极快病毒病菌4过后一氧化氮之前H2O2总体增高(上图2F)，所以NNT对H2O2止血来得有利于很不可或缺。

为了确切这些一氧化氮ROS的增高是不是与一氧化氮抗硝酸系统会有关，于是借助Western blotting审核一氧化氮之前过硝酸物亚基3(PRDX3)的硝酸长时间。H2O2通过PRDX3止血，即一对半胱氨硫多肽抑止PRDX3形成单体，并且必须通过TXN氢化这些半胱氨硫多肽才能氢化PRDX3的抗硝酸机能。PRDX3单体的积聚是PRDX3硝酸的标记，是一氧化氮酸中毒的常见标记物。

奥拉普芬是一种TXN氢化蛋白(TRXR)可胺，虽然奥拉普芬的病人就会引致PRDX3亚基大量硝酸，但NNT的不足之处并没有人增高PRDX3的硝酸(上图2G)。此以外，NNT的不足之处也没有人增大一氧化氮TXN2或TRXR2的亚基技术水平。总之，这些结果指明指出了NNT在NSCLC细胞内凋亡能够上发挥不可或缺起到，但NNT活适度的丧失并不就会损害一氧化氮TXN抗硝酸系统会，也不就会引致明显的酸中毒。

3 NNT的不足之处就会损害一氧化氮的硝酸能够

鉴于NNT在IMM之前的导向及其各种因素膜上质子能量密度和氢化能够，于是试上图探讨NNT对一氧化氮硝酸激素是不是不可或缺。首先，适用鲎细胞内以外能量密度学术研究仪顺利完成一氧化氮阻碍测试，审核NNT不足之处对一般一氧化氮硝酸机能的各种因素。结果推断出新NNT不足之处细胞内的耗氧量(OCR) 随一氧化氮可胺的依序是传导而被减缓(上图3A)。在在的是，NNT不足之处细胞内的最小换气能够在不举例来说非耦合换气的情形总体增大(上图3B)。这提示一氧化氮硝酸不足之处与NNT对质子位移的各种因素无关。鉴于NNT不足之处明显各种因素换气能够，于是扫描NNT不足之处的H441细胞内是不是比NNT理解细胞内有着来得少的硝酸和来得强的糖酵解能够。这指明指出这些细胞内在没有人NNT的情形也许通过一氧化氮NADPH来源而可维持一氧化氮的机能。

一氧化氮的硝酸激素举例来说ETC的机能，ETC由介导电子传导的Fe-S亚基亚基组合而成。受制于Fe-S亚基亚基的糖类来得有利于须要要NADPH，于是学术研究NNT扰乱后一氧化氮换气机能的增高是不是与Fe-S亚基涉及。一氧化氮阻碍测试可以对换气机能顺利完成一般适度的学术研究，但不可以对单个ETC亚基糖类顺利完成审核。因此，作者顺利完成了来得为专业的物理来学术研究Fe-S亚基依赖的换气涉及亚基(I, II, III)。结果推断出新，基于亚基I(硫和苹果硫)的摄取，在NNT扰乱后亚基I-III的活适度总体增大(上图3C)。此以外，NNT不足之处细胞内明显增大了琥珀硫的OCR，指明指出了增大了琥珀硫脱氢蛋白(SDH)活适度和亚基II-III流量(上图3D)。引致这一现像的不可或缺可能是SDH在ETC和TCA反向之前扮演着双重配角。

除了通过ETC可维持电子流量以外，Fe-S亚基还可维持对硝酸激素至关不可或缺的其他亚基蛋白的机能。为了确切NNT是不是参与其他Fe-S亚基的机能，作者审核了TCA反向之前Fe-S亚基——顺乌头硫蛋白(ACO2)的活适度。结果推断出新扰乱NNT总体增大了NSCLC细胞内系之前ACO2的活适度(上图3E)。ACO2活适度的增大也许就会毁坏TCA反向，进而减缓驱动ETC流量的氢化适度杂质的分解。为了补充非小细胞内心脏病之前ACO2机能的学术研究，于是评论者Nnt理解对KP心脏病之前ACO2活适度的各种因素。结果指明指出了，Nnt+/+激素之前Aco2活适度明显高于NntΔex7-11/+ 和NntΔex7-11/Δex7-11之前的，不够Nnt的展现出新最低的活适度(上图3F)。

4 以外源适度NADPH在NNT不足之处后可维持Fe-S亚基机能

为了确切与扰乱NNT涉及的一氧化氮Fe-S亚基机能的增大是不是与NADPH:NADP+的增大有关，我们试上图提供一种一氧化氮NADPH的以外源适度来源。为了实现这一最终目标，我们选择了酵母一氧化氮之前NADH激蛋白pos5p，它可以磷硫化NADH而转化成NADPH。虽然pos5p直到现在在芽孢之前也有以外源理解，但据我们津津乐道，pos5p还没有人被引入哺乳动物系统会。为了扫描我们是不是能够有效地在人类NSCLC细胞内的一氧化氮之前理解pos5p亚基，我们对酵母亚基顺利完成了结构上，使其包含HA-tag。Western blot%-，在H1299、H2009和PC9细胞内的一氧化氮之前失败理解了HA-tag标记的pos5p亚基(上图4A)。选择这些细胞内系是为了审核pos5p重建和NNT不足之处涉及的Fe-S亚基不足之处的能够，推断出新扰乱NNT后对它们造成很严重的各种因素。

pos5p的理解保住了细胞内之前扰乱NNT后引致的NADPH: NADP+比重的减缓(上图4B)。这与理解pos5p细胞内之前pos5p扰后换气碱基比较简单大型活动的减缓有关(上图4C和4D)。此以外，pos5p的理解完全保住了NNT扰乱后ACO2活适度的增高(上图4E)。总之，这些图表指明指出了可维持NNT理解不足之处时NADPH的技术水平可以维护NSCLC细胞内之前Fe-S亚基的机能。

5 NNT的不足之处不就会毁坏Fe-S亚基的糖类

受制于一氧化氮以外源适度NADPH能够西移动NNT不足之处涉及Fe-S亚基的不足之处，并且NADPH是高效可维持Fe-S亚基糖类的必备条件，因此我们接下来试上图确切NNT活适度是不是可维持这一来得有利于。Fe-S亚基糖类再次发生在一个由半胱氨硫甲醇蛋白(NFS1)和Fe-S支架亚基(ISCU)组合而成的多亚基亚基之前。亚基之前任何一种糖类的不足之处亦就会各种因素糖类，并且也与一氧化氮不足之处涉及。因此，我们扰乱NFS1或ISCU理解来学术研究毁坏Fe-S亚基糖类后对换气碱基和ACO2的各种因素。

在H2009细胞内之前，扰乱NFS1后总体增大硫/苹果硫重排和琥珀硫重排之前换气碱基亚基I-III的活适度，而在PC9细胞内之前只有亚基II-III活适度被明显增大(上图5A和5B)。另以外，两个细胞内系之前，在硫/苹果硫和琥珀硫的起到下，扰乱ISCU理解后总体西移动了OCR(上图5A和5B)。并且扰乱NFS1或ISCU后总体增大了细胞内系之前ACO2活适度(上图5C)。有趣的是，NNT扰乱后所引致的不足之处与Fe-S亚基糖类所须要杂质造成的不足之处是同等不可或缺的(上图5A-5C)。

为了证明Fe-S亚基不足之处对NSCLC细胞内的一氧化氮激素有机能适度各种因素，我们对扰乱NNT或ISCU细胞内顺利完成基于液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)的激素组学学术研究。 对这些细胞内TCA反向的激素物顺利完成学术研究，%-大多数之前间产物的原子量再次发生了总体彻底改变(上图5D)。这些都指明指出了了硝酸激素的严重毁坏和Fe-S亚基机能不足之处的一致适度。具体地说就是扰乱NNT和ISCU理解后，硫、苹果硫和富马硫被可用。NNT不足之处细胞内之前的柠檬硫技术水平被耗尽，但扰乱ISCU细胞内之前并没有人此结果。另以外，扰乱ISCU细胞内之前琥珀硫大量积聚，而在NNT不足之处细胞内之前则不普遍存在此现像(上图5D)。

除了Fe-S亚基ACO2和SDH以外，TCA反向还举例来说另一种一氧化氮Fe-S亚基——硫辛硫合成蛋白(LIAS)的机能。LIAS对于硫辛硫的合成以及不可或缺硫辛硫盐自由基的二阶都比较关键，硫辛硫盐自由基由PDH (E2)和α-酮戊二硫脱氢蛋白(二氢硫辛酰胺S-琥珀酰转移蛋白，DLST)组合而成。LIAS对Fe-S亚基糖类的毁坏特别敏感，因为其Fe-S簇在羧酸来得有利于之前被可用掉，这就建议迅速地顺利完成亚基绑定。事实上，扰乱NFS1和ISCU理解就会大量减缓PC9细胞内之前PDH-E2和DLST的脂化，然而扰乱NNT对亚基脂化无各种因素(上图5E)。总的来说，这些图表指明指出了，NNT引致蛋白和激素不足之处，它们的不足之处与Fe-S亚基糖类的毁坏涉及，但NNT不也许直接各种因素这一来得有利于。这反映出新扰乱NNT和ISCU后对TCA反向转化成类似但又相异的各种因素。

6 NNT的不足之处毁坏脂肪硫激素

除了可用TCA反向以外，NNT不足之处细胞内的LC-HRMS激素组学学术研究指明指出了脂肪硫激素失调。扰乱NNT推动长碱基脂肪氨基肉碱的大量积聚，而长碱基脂肪氨基肉碱是脂肪硫β-硝酸的底物(上图6A)。鉴于在NNT不足之处细胞内之前普遍存在换气系统会不足之处，我们推测这些氨基肉碱的增高是由于脂肪硫硝酸减缓。我们推断出新在H1299和PC9细胞内之前OCR与仙人掌硫盐的硝酸有关，扰乱NNT后OCR增大(上图6B)。我们还捕捉到到NNT不足之处细胞内之前饱和脂肪硫和不饱和脂肪硫均大量积聚(上图6C)。脂肪硫合成须要要可用大量NADPH，而且NNT扰乱后NADPH的持续适度增大，于是我们认为这些脂肪硫技术水平的增高是由于以外源适度脂肪硫摄入的增高。另以外，我们推断出新，NNT不足之处细胞内减极快了对荧光仙人掌硫酰胺的吸收能够(上图6D)。为了评论者NNT扰乱后脂肪硫的积聚是不是是一个潜在的长期适度，我们适用饱和脂肪硫仙人掌硫酯刺激NNT不足之处细胞内24同一时间，推断出新NNT扰乱后使H1299和H2009细胞内对仙人掌硫盐敏感(上图6E)。此以外，NNT扰乱后总体提升了H1299和PC9细胞内对单一不饱和脂肪硫油硫盐的持久适度(上图6F)。鉴于以外源适度脂肪硫补充的有害各种因素，我们原订细胞内以外人体内可用将维护NNT的不足之处。引人惊讶的是，培养基之前的人体内可用随之而来了NNT的持续上升(上图6G)。来得不可或缺的是，NNT扰乱后细胞内以外人体内举例来说就会增高NADPH的可用(上图6H)，这指明指出了在不够以外源适度脂肪硫的情形被迫合成脂肪硫，使NNT不足之处细胞内之前NADPH的持续适度增大。总的来说，这些图表指明指出了NNT也许在调节脂肪硫激素之前起不可或缺起到，NSCLC细胞内的脂肪硫激素紊乱也许是一个可借助的却是。

7 NNT不足之处后一氧化氮小分子过硝酸氢蛋白(MitoCatalase)保住Fe-S亚基机能

Fe-S亚基对分子氧和来得多有害杂质的硝酸比较敏感。虽然我们没有人捕捉到到一氧化氮亚基抗硝酸系统会的硝酸长时间再次发生彻底改变，但这并不排除NNT扰乱后引致的一氧化氮ROS足够将这些持久适度底物硝酸。为了探究这种也许适度，我们适用了一氧化氮小分子的过硝酸氢蛋白(MitoCatalase)来减极快一氧化氮的抗硝酸能够。我们失败地在H1299、H2009和PC9细胞内之前过理解了MitoCatalase (上图7A)。MitoCatalase的理解也部份西移动了NNT扰乱后涉及一氧化氮之前H2O2的转化成(上图7B)。这与NNT扰乱后换气碱基比较简单大型活动的减缓相对可不(上图7C和7D)。另以外，MitoCatalase的理解恢复NNT扰乱后ACO2的活适度(上图7E)。综上所述，这些图表指明指出了，提升一氧化氮止血H2O2的能够可以避免NNT扰乱后Fe-S亚基再次发生不足之处，从而使NNT在避免Fe-S亚基再次发生硝酸方面发挥起到，但对Fe-S簇的糖类无起到。

结论

总之，我们的学术研究指明指出了，NNT对心脏病生物学有着不可或缺意味，主要是通过调控Fe-S亚基而推动一氧化氮激素。与以往评论者NNT机能的学术研究相异，我们描述了NNT对NSCLC之前一氧化氮硝酸氢化参量的微妙各种因素。在NSCLC之前，NNT活适度也许大大降低了大量硝酸激素引致的酸中毒重排。我们的推断出新有利于指明指出了了一氧化氮激素在心脏病再次发生之前的必要适度，指明指出一氧化氮机能的减极快也许是心脏病病人的一个不可或缺内源适度。蛋白TPH-1对肾脏维护起关键起到，也许作为病人CKD的潜在病人内源适度。

原始出新处：

Ward NP, Kang YP, Falzone A, Boyle TA, DeNicola GM. Nicotinamide nucleotide transhydrogenase regulates mitochondrial metabolism in NSCLC through maintenance of Fe-S protein function.J Exp Med (IF: 10.892). 2020 Jun 1;217(6):e20191689. doi: 10.1084/jem.20191689.